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腺相關(guān)病毒 (AAV) 是基因治療中使用最-廣泛的傳遞機制。近年來，基于AAV病毒所開發(fā)的基因療法的研發(fā)及臨床試驗注冊數(shù)量也呈指數(shù)級增長。截止本文撰寫之時，美國食品和藥物管理局已批準(zhǔn)五項AAV療法，也是全球市場上最為昂貴的藥物，其中售價最高的Hemgenix®，每劑約為350萬美元。由于該療法每劑量可能需要1011-1016病毒載量，如何實現(xiàn)高效的AAV生產(chǎn)，已成為工藝流程優(yōu)化中的重要一環(huán)。
在病毒生產(chǎn)工藝方面，除了需要克服細胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙，以實現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低細胞毒性；增強子的加入，可大幅度提升多種血清型AAV病毒生產(chǎn)載量。但Mirus并沒有止步于此，為了進一步提高下游生產(chǎn)中的AAV病毒基因組產(chǎn)量， 今年七月底Mirus發(fā)布用于AAV生產(chǎn)的RevIT™ AAV Enhancer，可搭配Mirus TransIT-VirusGEN® GMP 轉(zhuǎn)染試劑或其他品牌轉(zhuǎn)染試劑 (PEI)。基于HEK293懸浮細胞數(shù)據(jù)，相對于老版本AAV生產(chǎn)，RevIT™ AAV Enhancer可提高AAV基因組滴度1.2-4.9倍，并且便于使用，很容易整合入現(xiàn)有AAV生產(chǎn)工藝工作流程中。Mirus RevIT™ AAV Enhancer的推出，使得AAV上產(chǎn)上游成本進一步降低成為可能，降低了基因治療單劑量成本。
● RevIT™ AAV Enhancer：可1.2-4.9X提升AAV病毒基因組滴度
平行對比Mirus TransIT-VirusGEN®搭配老版本AAV增強子(VirusGen + Enh 1.0)以及新版本RevIT™ AAV Enhancer (VirusGen + RevIT)，針對不同血清型 AAV2、AAV8、AAV9，AAV基因組滴度分別有著1.6、4.9以及1.2倍提升。除此之外，實驗結(jié)果顯示，在測試的所有血清型中，使用RevIT™ AAV Enhancer也在不同程度上得到更高比例的實心率 (圖1)。實驗結(jié)果表明，在搭配Mirus TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑時，可顯著提高病毒基因組滴度(GC/mL)及實心率(%Full Capsids)。
?圖1. 在加入RevIT™ AAV Enhancer后，相比Mirus老版本增強子，可1.2-4.9X提升AAV基因組拷貝數(shù)，改善AAV病毒實心率。
● RevIT™ AAV Enhancer：具有廣泛適配性，可搭配其他品牌轉(zhuǎn)染試劑（PEI），AAV病毒基因組滴度有著顯著提升
平行測試兩個品牌轉(zhuǎn)染試劑：Polyplus FectoVIR® 病毒轉(zhuǎn)染試劑(“Polymer F")以及Polyplus PEIpro®病毒轉(zhuǎn)染試劑(“Polymer P")，在加入Mirus RevIT™ AAV Enhancer，針對不同血清型AAV2、AAV8、AAV9，AAV基因組滴度分別有著1.7-2.0x、1.7-2.2x、2.2-2.3x提升(圖2)。實驗結(jié)果表明，在搭配其他品牌病毒轉(zhuǎn)染試劑時，Mirus RevIT™ AAV Enhancer可顯著提高AAV病毒基因組滴度(GC/mL)。
?圖2. “Polymer F"以及“Polymer P"病毒轉(zhuǎn)染試劑，在搭配Mirus RevIT™ AAV Enhancer，針對不同血清型，其AAV病毒基因組滴度都有著顯著提升。
● RevIT™ AAV Enhancer：具有廣泛的適配性，可適用于不同培養(yǎng)基體系
TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑搭配RevIT™ AAV Enhancer，在不同類型病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基中，具有很好的兼容性。測試使用293-VP 2.0細胞，搭配培養(yǎng)基類型包括VPM (Thermo Fisher) 及 BalanCD HEK 293 (Irvine Scientific)。實驗結(jié)果表明，針對不同血清型AAV2、AAV5、AAV8、AAV9，RevIT™ AAV Enhancer在不同培養(yǎng)基實驗條件下，AAV病毒基因組滴度提升方面并無顯著差異。
?圖3. 更換不同品牌病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基，AAV病毒基因組滴度的增加無顯著差異。
● RevIT™ AAV Enhancer：實驗流程靈活性，不同加入時間窗口有著近似表現(xiàn)
為了進一步確定加入RevIT™ AAV Enhancer可有效提高AAV病毒基因組載量，是否需要嚴(yán)格把控加入時間窗口。平行測試不同加入時間點，包括轉(zhuǎn)染前30或60分鐘、轉(zhuǎn)染時及轉(zhuǎn)染后。實驗結(jié)果顯示，相對于對照，在加入RevIT™ AAV Enhancer不同測試時間點， AAV8病毒基因組滴度都有穩(wěn)步的提升(2倍)，并且病毒實心率穩(wěn)定保持在相同水平。該組實驗結(jié)果表明，RevIT™ AAV Enhancer加入時間點的靈活性，一定程度上簡化了生產(chǎn)工作流。
?圖4. RevIT™ AAV Enhancer加入時間點的靈活性
● 實驗tips：如何進行病毒轉(zhuǎn)染試劑評估？什么是病毒載量？如何檢測？
更多詳細信息，請查看Technical Resources中Virus Titer Reference Card
? 相關(guān)產(chǎn)品信息
| 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 | 鏈接 |
| RevIT™ AAV Enhancer | 1.5 ml | MIR 8000 | link |
| 10 x 1.5 ml | MIR 8006 | ||
| VirusGEN® AAV轉(zhuǎn)染試劑及RevIT™ AAV Enhancer | For 1L of Culture | MIR 8007 | |
| For 10L of Culture | MIR 8008 | ||
| TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑 | 0.3 ml | MIR 6703 | link |
| 0.75 ml | MIR 6704 | ||
| 1.5 ml | MIR 6700 | ||
| 5 x 1.5 ml | MIR 6705 | ||
| 10 x 1.5 ml | MIR 6706 | ||
| 30 ml | MIR 6720 | ||
| TransIT-VirusGEN® GMP級別轉(zhuǎn)染試劑 | 150 ml | MIR 6845-GMP | link |
| VirusGEN® AAV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 kit for 1 L of cell culture | MIR 6750 | link |
| VirusGEN® GMP級別AAV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 Kit - for 50 L of cell culture | MIR 6815-GMP | link |
| VirusGEN® LV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 kit for 1 L of cell culture | MIR 6760 | link |
| VirusGEN® GMP級別LV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 Kit - for 50 L of cell culture | MIR 6825-GMP | link |
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